热休克蛋白基因的转录稳定性和细胞增殖率提供了一个优越的证据细胞。Sahiwal公差(Bos indicus)牛PBMCs夏天压力

文摘

季节性变化赋予环境压力在乳制品的动物,会损害动物健康和生产力。为了测量一个特定品种的表现能力/动物对热应力,必须确定其耐热性能力。热休克蛋白(休克)分子说法保持天然构象的蛋白质和细胞生存能力在压力期间。外周血单核细胞(PBMCs)被广泛用作细胞模型来理解微分热休克反应在牲畜的物种。目前调查试图与季节性变化的假设会导致变化的热休克蛋白转录水平乳制品品种。因此,本研究旨在评估热休克蛋白家族基因的转录稳定性和细胞增殖率。Sahiwal牛(Bos indicus),荷斯坦牛(牛)和默拉水牛(Bubalus狷羚)。热休克蛋白家族基因的基础表达水平(HSP27、HSP40 HSP60, HSP70和一半)分析了在PBMCs夏季和冬季旺季。相比。Sahiwal默拉水牛、奶牛和相对数据显示显著诱导HSP70表达,HSP40 HSP60,一半mRNA在高频奶牛夏季压力。细胞增殖数据进一步表明显著(p < 0.05),抑制细胞增殖的荷斯坦奶牛夏季压力。休克蛋白mRNA转录数据稳定大局和细胞增殖建议更好的生存能力。Sahiwal牛PBMCs夏天压力相比,高频头奶牛。

关键字

热休克蛋白(HSP)基因、基因表达、细胞增殖率,夏季压力。Sahiwal牛、荷斯坦奶牛。

介绍

印度是被赋予了巨大的农业生物多样性丰富,农场动物生物多样性在农村经济中起着主导作用。大量和不同范围的农业生态区在印度帮助开发大量的自然进化牛和水牛河的品种。印度本地牛(Bos indicus)和水牛(Bubalus狷羚)被认为是主要产牛奶的物种在印度次大陆,因此其生产性能在夏季压力是对农民具有重要意义以及奶制品行业。本机牛遗传资源是几个世纪以来农民经济的支柱产奶以及权力草案。印度大约有超过2.0458亿或超过总数的15.97%世界人口和牛是一些最好的瘤牛(Bos indicus)品种由37个定义良好的品种。除了这些,许多鲜为人知的牛的数量也展开长度和宽度的国家各有自己的特色。很多品种的潜力不仅幸存下来而且维持生产,在各种恶劣气候条件下繁殖和畜力。印度本地牛即Tharparkar、哈里亚纳牛。Sahiwal, Rathi,吉尔,Kankrej和Nagori等以适应高温、生产潜力和强大的通风能力。与此类似,印度水牛被赋予了巨大的丰富的多样性和有超过9690万水牛构成世界总数的一半以上(56.8%)(1.704亿)和亚洲水牛人口的58.9%(1.654亿),分别(粮农组织2004)。印度有13个定义良好和多样的河边的水牛品种,以高产、脂肪丰富的牛奶和他们的适应性特征。水牛乳制品行业有特殊的意义在印度和贡献超过50%的牛奶总产量除了地位畜力和肉类来源。虽然水牛也适合炎热和潮湿的气候却表现出痛苦的迹象,当暴露于太阳直射或工作时太阳在炎热的天气。据报道,牛奶产量、生长速度和生育时期的水牛被还原高环境温度(1]。这是由于这样的事实,水牛吸收大量的太阳辐射,因为他们的黑皮肤和稀疏的外套或头发。另外,他们拥有一个低效率的蒸发冷却系统因其而出汗能力差。同时,水牛皮肤汗腺密度的六分之一,牛的皮肤,所以水牛出汗散热不佳。在热应力下,水牛的体温,脉搏,呼吸率和一般不适迅速增加。在水牛产奶量减少的热应力是一个主要关心乳制品行业在印度。

许多畜牧企业的热应力是一个重要的问题。热应激对奶牛的影响的动物已经被很好的记录(2- - - - - -6),包括减少投料但更大的营养能量需求,生育能力下降,呼吸和心率增加,气喘吁吁的活动,增加外周血流和出汗,减少牛奶产量,降低牛奶质量。总的来说,这些变化表明,有动物的主要压力,最终导致频率增加的健康相关问题如乳腺炎,瘤胃酸中毒和酮症7]。这些影响会导致重大损失的收入和增加管理成本。估计平均动物损失产生的热应力对美国乳制品行业是保守估计每年约9亿美元(雷竞技官网8]。近年来这些忧虑增加了更多的奶牛场的全球变暖,努力增加牛奶产量最大化。然而,随着的增加牛奶产量和干物质摄入增加,牛的代谢热功率的增加,进而增加对热应力的敏感性(9),不仅影响群牛奶产量和收入,但对奶牛的影响生育,健康和福利持续超出季节天气炎热,这些损失的两倍。

汉森(3)报道,瘤牛有更好的调节体温的能力,以应对热应力比牛磺酸牛品种的欧洲血统。然而,到目前为止没有系统的尝试比较细胞容忍印度本地牛(Bos indicus),异国情调的牛(牛)和水牛(Bubalus狷羚)向热应力。在细胞水平上,外周血单核细胞(PBMCs)利用作为一个潜在的模型来评估微分热应激反应在牛和其他牲畜品种(10- - - - - -15]。本研究进行目标分析HSP的基因差异表达基因PBMCs印度牛(Bos indicus) Holstein-Friesian(高频)牛(b .金牛座)和印度水牛(b .狷羚)耐热性和季节性变化的适应机制。

乳制品品种特别是高产动物通常是更敏感的热应力,产生更多的代谢热(16]。热应力效应变得更加不利时热应力是伴随着高环境湿度(1]。这个问题有着特定的意义,当全球变暖的场景。长时间暴露在高温湿度指数,减少泌乳奶牛驱散热量的能力。调节体温,动物的身体经历了几种自适应机制在生理和细胞阶段。生理变化包括皮肤外层的血管扩张,使血液流向皮肤表面的有效的热损失,汗液在皮肤表面通过汗腺产生冷却效果。

PBMCs作为细胞模型和热休克反应被广泛探索合适的评估者的热应力在细胞水平上10,11)包括季节性变化的影响和适应机制(10,11,17]。对适应热应力、牛磺酸和indicine牛以及印度水牛反应不同,因为他们表现出不同的形态,解剖和生理参数(3和展览微分细胞反应12]。在细胞热休克蛋白有显著作用宽容(18)及其表达式作为一个潜在的动物适应严酷的环境压力指标(3]。本研究目的是评估进行转录稳定PBMCs HSP基因和细胞增殖率的。Sahiwal (Bos indicus) Holstein-Friesian (牛)牛和默拉水牛(Bubalus狷羚)来洞察他们的夏天比较耐热性能力的压力。

材料和方法

材料

样品由52个正式注册成人Minorcan马(24男性和女性28日)超过2.5岁(范围从3 - 16年,平均8年)。动物属于48个不同的所有者,并保存在不同的当地的农场和骑中心,统一管理和饲养条件在所有位置。

样品收集

在目前的研究中,总共15哺乳期乳制品动物,5每个默拉水牛(Bubalus狷羚)、。Sahiwal (Bos indicus)和Holstein-Frisian (牛)牛了。。Sahiwal牛和默拉水牛纳入国家乳制品的研究属于养牛场研究所(NDRI) Karnal,荷斯坦奶牛黑白花奶牛维持在附近的私人养牛场。收集血液样本(15毫升)从颈静脉EDTA涂布vaccutainers在炎热的夏天(7月平均温度为41±1°C和温度湿度指数≥85)和寒冷的冬季(12月的月平均温度12±1°C和温度湿度指数≤72)。抽样程序是按照研究所进行的动物伦理委员会的指导方针。

分离外周血单核细胞

收集血液样本中处理2 h PBMCs隔离如我们之前所述研究[12]。简而言之,整个血液稀释1 x PBS (Ca^{2 +}和毫克^{2 +}免费的;犹他州Hyclone),轻轻放在histopaque - 1077(美国σ-奥尔德里奇Inc .)在室温下。混合物在400 g离心30分钟。等离子体被丢弃和白色单核细胞环吸气管。吸气细胞治疗2.0毫升的冷冻过滤红细胞裂解缓冲2分钟。立即消散后,8.0毫升1 x PBS (Ca^{2 +}和毫克^{2 +}免费的;Hyclone Ultah)添加和离心机260 x g 10分钟去除histopaque - 1077和红细胞表面的痕迹。洗1 x PBS的PBMC颗粒出现2次。小整除的纯化细胞(9.0μl)和1.0μl台盼蓝染料对细胞的生存能力。

测量细胞增殖率

PBMCs的细胞增殖率是衡量使用CyQuant细胞增殖测定(分子探针)。CyQuant细胞增殖试验是基于主体的DNA在每个给定细胞系的细胞保持不变或细胞类型,所以基于DNA化验内容可以用来提供一个准确和简单的细胞数量。手术后根据制造商的指示。总之,纯化PBMCs细胞颗粒悬浮在1 x hbs缓冲区。50μl整除包含105个细胞的细胞悬液在微型板块井配发一式三份。然后,2 x 50μl染料绑定解决方案添加到每个微型板块井和孵化的板37ºC 45分钟。这个孵化的平衡需要dye-DNA绑定,导致稳定的荧光端点。最后每个样品的荧光强度测量使用荧光板与激发读者(珀金埃尔默维克多X3) 485 nm和排放检测在530海里。

RNA隔离和互补脱氧核糖核酸的合成

总RNA提取和互补脱氧核糖核酸合成中描述执行之前的研究(12]。介绍过o。d。邓肯高质量RNA(平均260/280 ≥ 2.0) as estimated using NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies) was used for cDNA synthesis. The integrity of total RNA isolated was checked by visualization of 18s and 28s ribosomal bands on 1% denaturing agarose gel. The quality of synthesized cDNAs was checked using semi-quantitative PCR. A gene-specific PCR amplification was performed in 10 μl reaction mixture containing 4 μl of cDNA template, 0.4 μl of forward and reverse primer each (working concentration - 4pmol), 1 μl PCR buffer (1X), 0.75 μl MgCl2(1.5 mM), 0.5 μl dNTPs (200 μM) and 0.2 μl Taq DNA polymerase (1.0 U) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Amplification was performed in Master cycler gradient thermal cycler (Eppendorf, Germany) using thermal cycling conditions as 95°C for 2 min, followed by 35 cycles of 95°C for 30 s, 60°C for 30 s, and 72°C for 30 sec with a final extension at 72°C for 5 min. The amplicons were analyzed for their specific size by agarose (1.5%) gel electrophoresis.

定量实时聚合酶链反应

qPCR执行使用光周期计480仪器(罗氏公司、德国)。每个反应在96白色板(罗氏公司、德国)是由4μl稀释cDNA结合6μl的混合物组成的5μl 2 x LightCylcer 480 SYBR绿色我主人混合(罗氏公司、德国),0.4μl每10μM正向和反向引物,和0.2μl DNase /核糖核酸酶游离水。对于每一个基因,样本在重复运行(技术复制)连同6点加上non-template CTR相对标准曲线。放大的反应进行条件:在50°C 2分钟,10分钟在95°C, 40周期15 s在95°C(变性),和1分钟60°C(退火+扩展)。离解协议增量温度为95°C 15 + 65°C 15年代被用来调查qPCR反应的特异性和引物的存在。主要的热休克蛋白基因的基础表达水平(HSP27、HSP40 HSP60, HSP70和一半)中描述表1分析了PBMCs样本。mRNA表达数据的分析在不同的样本是基于循环阈值(CT)值。HSP基因的表达水平,评估的循环阈值(CT)值规范化使用β-actin (ACTB)作为内部控制基因。每个目标基因的CT值减去β-actin CT值的计算ΔCT。方差分析(方差分析)进行,以确定是否存在显著差异的分析变量使用GraphPad棱镜在不同组5.0版本(La Jolla、钙、美国)统计软件包和组之间的差异测试图基的多重比较检验。P值小于0.05和0.01被认为是重要的。

结果

理解之间的关系表达式的稳定性主要监护人,动物类型和季节性变化,qPCR表达数据生成在。Sahiwal PBMCs样本牛(Bos indicus),异国情调的荷斯坦弗里斯兰语(牛)牛和默拉水牛(Bubalus狷羚)。本研究的主要目标是确定季节性变化是否影响转录的主要监护人和细胞增殖率。Sahiwal PBMCs的荷斯坦弗里斯兰语牛和默拉水牛。获得了高质量的RNA的PBMCs样本的A260 / A280比率为2.07±0.04。Sahiwal牛,2.10±0.62高频牛和2.08±0.05默拉水牛。融化曲线分析qPCR反应单峰值为每个基因表示特定的和高效的PCR扩增(R2范围从92.50到115.0,表1)。

在不同HSP基因分析,HSP70显示主要区别表现水平在荷斯坦弗里斯兰语褶皱变化为4.55牛(p < 0.001),紧随其后的是1.73折的变化默拉水牛(p = 0.31)和褶皱的变化-0.31。Sahiwal奶牛(p = 0.50)在夏季冬季。HSP70 mRNA的相对表达数据显示最大感应荷斯坦弗里斯兰语牛在夏季(图1和2)。其表达也高默拉水牛虽然增加非重要(p > 0.05)。另一方面,只有轻微的变化是观察HSP70 mRNA的表达。Sahiwal牛在两个赛季。类似于HSP70, HSP40 mRNA显示显著(p < 0.05)感应荷斯坦弗里斯兰语,与默拉水牛诱导(p > 0.05),几乎没有变化。Sahiwal奶牛夏季与冬季期间(图1和2)。两个监护人(以及HSP60)成绩单显示类似的模式,与荷斯坦弗里斯兰语感应最高,其次是默拉水牛和。Sahiwal奶牛。有趣的是,HSP27 mRNA表达显示反向趋势虽然与(p > 0.05)在冬季与夏季相比,在所有动物类型(图1和图2)。虽然很难解释这种趋势但可能提出的一个原因是,HSP27可能组成型表达,可能不是一个非常敏感的标记等夏天压力与其他研究研究动物的陪伴。

动物类型在不同的乳制品在目前的研究中,分析了。Sahiwal牛表现出最低的表情褶皱变化与差异的HSP基因(褶皱变化HSP27 = 0.36, p = 0.24;HSP40 = 0.08, p = 0.78;HSP60 = -0.22, p = 0.59;HSP70 = -0.31, p = 0.51;一半= -0.33,p = 0.33)在夏季冬季。然而,荷斯坦奶牛弗里西亚显示最大差异HSP40(褶皱变化= 1.28,p = 0.04), HSP70(褶皱变化= 4.55,p < 0.001)和一半(褶皱变化= 1.20,p = 0.0),默拉水牛显示最大差异HSP27(褶皱变化= -0.93,p = 0.20)和HSP60(褶皱变化= 1.07,p = 0.03)在夏季和冬季。

此外,除了分析个别HSP mRNA表达的可诱导性夏天压力,我们也评估的总体变化表达式模式四个HSP成绩单(HSP70、HSP40 HSP60和一半)结合表达数据。分析是由包括HSP27 mRNA表达的价值观。这样做主要是为了评估、HSP27 mRNA数据显示不同的表达趋势是否有任何影响整体休克蛋白表达模式。我们的分析显示,HSP27的表达值没有影响结合表达数据集(图3)。一起集中表达数据的所有热休克表现出类似的趋势,个别HSP mRNA。HSP70的表达值总和,HSP40 HSP60和一半基因一起显示最大值和显著(p < 0.01)感应荷斯坦奶牛Frisien相比。Sahiwal牛和默拉水牛(图3)。

细胞增殖数据显示显著(p < 0.05),抑制细胞增殖的荷斯坦奶牛其次是默拉水牛在夏季压力(thi - 85;图4)。的PBMCs。Sahiwal牛显示更耐热的压力,因为他们的细胞增殖率的下降是少得多比荷斯坦和默拉水牛。

讨论和结论

最近,重点是理解分子机制适应在牲畜品种对气候变化特别是热应力。现在的事实有可变性品种或物种水平容忍环境热负荷。然而,这样的数据严重缺乏对印度本地牛和水牛品种与优越的耐热性被认为是进化能力比异国情调的同行。目前的调查试图与季节性变化的假设会导致热休克蛋白转录水平的变化在不同程度上在乳制品品种适应热带和温带气候条件。因此,本研究旨在评估休克蛋白的相对表达谱(HSP40 HSP60, HSP70和一半)成绩单的循环PBMCs Bos indicus (。Sahiwal)牛,牛(荷斯坦弗里斯兰语)牛和Bubalus狷羚(默拉)水牛在夏季和冬季。异国情调的荷斯坦奶牛显示最大感应的PBMCs HSP成绩单(HSP70、HSP60 HSP40和一半)相比,关于热带方面适应默拉水牛和。Sahiwal奶牛夏季压力。在所有HSP基因检查在这项研究中,HSP70被发现大多数诱导黑白花牛黑白花奶牛(图1)。这是预期HSP70表达中被认为是最引起热应力以稳定蛋白质的天然构象和维护细胞的生存能力(贝克汉姆et al ., 2004)。观察到的增加其表达由于夏季压力按照研究在不同畜牧物种进行(10,12,19- - - - - -22]。

除了HSP70;HSP40 HSP60,一半热休克蛋白基因为耐热性也进行了研究。HSP40一半寿命和一般函数作为co-chaperone /代数余子式的哺乳动物HSP70和复杂的蛋白质参与恢复确认后热休克(23- - - - - -25]。HSP60是另一个重要的分子监护人在不同压力条件下(26]。这些热休克的主要作用称为分子说法,确保正确的蛋白质折叠和凋亡调节生理压力条件。放在一起,相对的mRNA表达HSP40, HSP60,一半是明显高于夏季与冬季相比在荷斯坦奶牛。研究结果类似于山羊不同热休克的观察(11]。观察到更高的大量的热休克是至关重要的在夏天提供cytothermal保护压力(27,28]。一些报道也证明了热休克的重要作用在细胞生存在热应激条件下体外和体内(12,14,29日]。

本研究的细胞增殖数据确证与我们先前的调查结果(12],百分比减少细胞生存能力特别是PBMCs加热后压力最高的荷斯坦奶牛其次是默拉水牛和。Sahiwal奶牛。目前的研究表明,PBMCs。Sahiwal牛(Bos indicus)这是一个适应热带印度夏天更好的生存压力条件相比Hostein弗里西亚牛(牛)。这些结果与早期的发现是一致的,较小的有害影响的高温观察细胞和胚胎preimplatation Bos indicus牛(3,30.,31日]。

总之,休克蛋白mRNA表达和细胞增殖率的程度。Sahiwal PBMCs、荷斯坦弗里斯兰语牛和默拉水牛显示差异的能力改善热应力的有害效应,以维持细胞的完整性。HSP成绩单。Sahiwal牛显示最低的变化与季节变化表达式。这为其提供了一个证据更好的细胞耐受性和适应性比奇异的荷斯坦奶牛。另一方面,黑白花牛黑白花奶牛动物丰度较高的四个主要HSP成绩单(一半,HSP70、HSP60 HSP40)在夏季表明其较低的耐环境热负荷,特别是在热带条件。尽管热休克反应是一种进化保守的机制,不同的品种/物种见本研究可能不同的固有能力在热休克诱导HSP合成。高表达热休克和细胞增殖率低的荷斯坦奶牛很可能是与动物的高应力状态有关,需要更多的生产热休克蛋白质应对压力状态。

承认

支持的工作是印度农业研究理事会,新德里在国家的计划。作者正式承认,导演NBAGR Karnal扩展这项研究的研究设施。

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