胰蛋白酶:小说超氧化物阴离子的清道夫

文摘

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶的消化系统中找到许多脊椎动物水解蛋白。胰蛋白酶的过氧化物清除活动被意外发现。结果表明,胰蛋白酶能清除超氧化物intracorporal和体外系统。公里的价值提出的超氧化物清除胰蛋白酶是0.0618毫米的速度过氧化物清除增加了0.103μM /μg胰蛋白酶/分钟的增加过氧化氢产量上限0.00122μM /μg胰蛋白酶/分钟。胰蛋白酶的最佳操作pH值在7.5 - -8.5。胰蛋白酶的清除活动加速了铜和阻碍金属螯合剂。这些不容置疑的结果表明,胰蛋白酶是一种新型超氧化物的清道夫。超氧化物清除的速率和过氧化氢生产影响的浓度胰蛋白酶或核黄素,pH值或离子。胰蛋白酶可能是一个潜在的药物在人类抗氧化压力

关键字

铜、电子自旋共振、清除活动,过氧化物,胰蛋白酶。

缩写

二乙基二硫代氨基甲酸,DDC:;ESR:电子自旋共振;H₂O₂:过氧化氢;ROS:活性氧;O₂超氧化物阴离子;SOD:超氧化物歧化酶。

介绍

活性氧(ROS)是一种无处不在的分子包括超氧化物阴离子(O₂-。)、过氧化氢(H₂O₂)和羟基自由基(1,2]。ROS调节信号转导级联的关键步骤和许多重要的细胞活动,例如蛋白质磷酸化、基因表达、转录因子激活、DNA合成和细胞增殖2,3]。另一方面,细胞ROS是有毒的,因为他们破坏细胞组件。这是假设O₂-。由细菌产生的哺乳动物病原体如粪大肠可能会扮演一个毒力因子(4]。因此,细胞内防御superoxide-mediated损害是健壮的5,6]。

免受活性氧可能包括内源过氧化氢酶等酶的生产,这削弱H₂O₂和超氧化物歧化酶(SOD),歧化酶O₂-。(7]。

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶的消化系统中找到许多脊椎动物,在水解蛋白(8]。在我们能接受的作品,胰蛋白酶被发现能够清除O₂-。同时生产的H₂O₂文化的细菌。本文的目的是描述这个啊₂-。清除胰蛋白酶的活动,在活的有机体内和体外。结果表明,胰蛋白酶是独立的活动₂-。清除酶的生物。

方法

细菌

大肠杆菌野生型菌株(MG1655)用于我们的工作是提供的请在微生物学系教授James a . Imlay,伊利诺伊大学乌尔班纳。应变MG1655维持在37°C LB培养基和培养48 h。一个殖民地在磅的液体培养基中培养一个额外的24小时获得大约每毫升109个细胞的悬浮。应变守恒在甘油和储存在-20°C到使用。

胰岛素治疗

胰蛋白酶(牛,500单位/毫克水晶)从Amersco购买。胰蛋白酶(100毫克毫升¹)的混合物添加O₂-。生产系统。的混合然后在37°C的环境中30分钟,和反应是停止25μl大豆胰蛋白酶抑制剂(10毫克毫升¹σ)。

定量测定超氧化物阴离子

O₂-。在VB制作₂(σ)的解决方案。O₂-。浓度测量通过测量ferricytochrome c减少如Huycke所述4]和总编Imlay [9]。

ESR谱。水平的啊₂-。不同菌株产生的电子自旋共振(ESR)测定光谱与钛试剂(10]。钛试剂(1 2-dihydroxybenzene-3 5-disulfonic酸,σ)不仅是一个激进的食腐动物,而且还将具体与O反应₂-。形成钛试剂半醌,被ESR达一阶导数光谱。钛试剂激进的稳定,可用于定量的O₂-。生产被麦克雷和汤姆森(11和李,et al。10]。ESR谱进行力量ER 200 D ESR谱仪。

过氧化氢生产测量

H₂O₂内容被AR /合方法检查报告的西维尔和Imlay12]。

外部因素的治疗方法

样品在0.5毫米铜孵化^{2 +}或25毫米EDTA二乙基二硫代氨基甲酸为0.5 h或1毫米(DDC) 1 h 28°C依照Takahama描述的方法等。13]。

统计:SPSS对Windows 11.5是用于统计分析。结果报告为均值±S.E.M.超氧化物阴离子之间的差异的重要性受到EDTA的影响,铜^{2 +}或者,DDC决心使用单向方差分析(方差分析)。值表示为显著(p < 0.05)或极显著(p < 0.01)。

结果

胰蛋白酶的作用啊₂-。研究了化学VB吗₂系统,在体外细菌培养,或者在生活,在活的有机体内。

清除胰蛋白酶的活动在不同的系统

可再生的结果从三个或更多独立的ESR化验表明,细菌细胞和VB₂系统生成O₂-。(图1 b和e)。在VB中钛试剂单独₂控制生产疲软的ESR信号(图1一个)。磅中等控制也产生一个小的ESR信号在钛试剂(图1 d)。在我们之前的作品中,钛试剂信号的振幅与SOD降低了95%以上(200毫升¹),确认ESR谱被来自O₂-。(10]。细菌悬液或VB₂解决方案产生胰蛋白酶(0.6毫克ml后没有ESR信号¹)治疗(图1 c和1 f)。

胰蛋白酶浓度对扫气的影响的活动

在胰蛋白酶,O₂-。清除和过氧化氢生产同时观察到。当胰岛素的浓度低于0.4毫克/毫升,过氧化氢生产保持一致的曲线的O₂-。清除。清除的速度啊₂-。保持在一个稳定但增长缓慢的性能,而过氧化氢产量显示一个明确的下降与0.4 - -1.0毫克/毫升胰蛋白酶(图2)。动力学常数,公里的胰蛋白酶,清除O₂-。在37°C,确定使用线编织伯克阴谋。公里的胰蛋白酶的价值是0.0618毫米胰蛋白酶浓度选择0.4毫克/毫升的进一步工作。

最初的过氧化物浓度对扫气的影响的活动

不同初始O的影响₂-。在两个H浓度₂O₂进化和阿₂-。清除测量。最初的阿₂-。浓度为54.8μM VB₂浓度为1.5×9 M在VB₂系统由细胞色素c的测定。H₂O₂进化与O率增加₂-。浓度由双重相反图(图3)。的速度啊₂-。扫气增加了0.103μM /μg胰蛋白酶/分钟的增加H₂O₂产量最高的0.00122μM /μg VB时胰蛋白酶/分钟₂浓度为2.5⁶×10⁹米(图4)。O的曲线₂-。清除是不符合它的H₂O₂生产。H的比例₂O₂在产品增加3 - 6×10⁹M VB₂而降低6.5 - -7.5×10⁹M VB₂。

外部因素对扫气的影响的活动

在O pH值的影响₂-。清除胰蛋白酶确定活动。结果表明,胰蛋白酶的最佳操作pH值在7.5 - -8.5。H的速度₂O₂生产的胰蛋白酶/ O₂-。反应逐渐减少,留学生在pH值的增加从5到10。的速度啊₂-。清除pH值几乎翻了一番,从5到6和相对H₂O₂生产比例随着pH值增加从6到9。后续实验进行pH值7.0近似生理条件。

胰蛋白酶可能被EDTA灭活。25毫米的EDTA,金属螯合剂、高度显著抑制O₂-。清除胰蛋白酶(活动图5)(p < 0.01)。超氧化物阴离子是进一步减少0.5毫米铜^{2 +}除了与胰蛋白酶的反应。1毫米,DDC,铜的螯合剂^{2 +}、高度显著抑制O₂-。清除活动(图5)(p < 0.01)。但是超氧化物阴离子浓度没有捡到原来的水平。监护系统的影响明显弱于EDTA (p < 0.05)。

讨论

我们确认了啊₂-。清除不同O胰蛋白酶的活动₂-。生产系统,包括体外化学VB₂系统,intracorporal活细菌培养(图1)。没有其他反应的反应物是必要的₂-。清除胰蛋白酶。细菌培养的意义的生物浓度超氧化物,胰蛋白酶能展览啊₂-。清除活动与内源性抗氧化剂的存在,比如草皮。胰蛋白酶可能有效和生物相关的条件下竞争。

在O的反应₂-。清除通过胰蛋白酶,H₂O₂被观察到的一个产品。的速度啊₂-。清除和H₂O₂生产影响的浓度胰蛋白酶或VB₂,它代表了最初的O₂-。浓度。胰蛋白酶的最佳浓度为0.4毫克/毫升O₂-。清除反应(图2)。在这个反应的初始阶段,H₂O₂生产包括与O₂-。清除。VB时₂浓度为2.5⁶×10⁹M H的比例₂O₂生产增加。而当VB₂浓度超出6×10⁹M H₂O₂生产显著下降(图3)。H的生产机制₂O₂和其背后的基本原理仍然是未知的。

结果表明,胰蛋白酶的最佳操作pH值在7.5 - -8.5。两个小时₂O₂生产和阿₂-。清除活动深受酸性pH值(图4)。

胰蛋白酶的反应,铜^{2 +}是一个必要的因素啊₂-。清除。添加EDTA显著抑制O₂-。清除胰蛋白酶(活动图5),验证反应是由于与重金属反应。由铜胰蛋白酶的促销活动^{2 +}证实,铜^{2 +}在O中扮演重要的角色₂-。胰蛋白酶的清除反应。的监护系统显著抑制O₂-。清除活动(图5),进一步验证了铜^{2 +}这个反应是一种有效的因素。抑制效果EDTA和监护系统之间的差异表明,其他金属离子(例如Ca^{2 +})可能参与胰岛素的反应。考虑到螯合EDTA或DDC很容易损害胰蛋白酶的活动,结合胰蛋白酶和铜离子之间不应该紧。胰蛋白酶和钙离子之间的相互作用已经得到证实,而胰蛋白酶和铜离子之间的相互作用尚未阐明。还需要进一步的工作。

类似于杆,胰蛋白酶进行清除O₂-。和可能是组件的细胞防御O₂-。压力。在胰腺中胰蛋白酶有高质量,可以很轻松地净化。因此它被广泛应用于各种生物技术过程。胰蛋白酶是常用的生物研究在蛋白质组学实验消化蛋白质肽质谱分析,如为胶液消化。而在未来,胰蛋白酶能用于O₂-。在各种条件下清除。

然而,仍然有许多问题的机制₂-。清除胰蛋白酶。胰蛋白酶是否与本机歧化作用竞争生物相关条件下(即可能生物的过氧化物浓度和蛋白质)吗?如果答案是肯定的,下面的问题是,这个过程如何与各种草地物种的催化作用。这是行动的胰蛋白酶或大或小的一个过程?目前尚不清楚在什么情况下胰蛋白酶可能作为SOD模拟。在生物系统这样的反应可能会发生什么?进一步intracorporal作品是迫切需要的。过氧化物清除的插图小说的活动胰蛋白酶应该带领我们到一个新的范围胰蛋白酶的抗氧化机制,揭示新的见解机制的酶。

结论

胰蛋白酶被证实是O₂-。清道夫。清除活动应受胰蛋白酶或初始O₂-。浓度。的最佳pH值区域₂-。清除通过胰蛋白酶是7.5 - -8.5。这个反应的铜是一种有效的因素。胰蛋白酶可能是一个潜在的药物在人类抗氧化压力。

确认

我们希望感谢教授James a . Imlay提供应变MG1655这项工作。测定超氧化物阴离子与仪器分析与研究中心的支持下,兰州大学。这项工作是由中国国家自然科学基金(31000017号和U1404334),和中国博士后科学基金会(20110490150)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

引用

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