胰蛋白酶:一种新型超氧阴离子清道夫

摘要

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，存在于许多脊椎动物的消化系统中，在那里它能水解蛋白质。胰蛋白酶的超氧化物清除活性是偶然发现的。结果表明，胰蛋白酶在体内和体外均能清除超氧化物。胰蛋白酶对超氧化物的清除率km为0.0618 mm，随着过氧化氢产生速率的增加，其对超氧化物的清除率可达0.103 μM/μg trypsin/min，最高可达0.00122 μM/μg trypsin/min。胰蛋白酶的最佳工作pH值为7.5-8.5。铜能促进胰蛋白酶的清除活性，金属螯合剂则能抑制胰蛋白酶的清除活性。这些结果表明胰蛋白酶是一种新型的超氧化物清除剂。胰蛋白酶或核黄素的浓度、pH值或离子对超氧化物的清除率和过氧化氢的产生有影响。胰蛋白酶可能是一种潜在的抗氧化应激药物

关键字

铜，电子自旋共振，清除活性，超氧化物，胰蛋白酶。

缩写

二乙基二硫代氨基甲酸,DDC:;ESR:电子自旋共振;H₂O₂:过氧化氢;ROS:活性氧;O₂超氧化物阴离子;SOD:超氧化物歧化酶。

简介

活性氧(ROS)是一类普遍存在的分子，包括超氧阴离子(O₂-.)、过氧化氢(H₂O₂)，以及羟基自由基[1，2］．ROS调控信号转导级联中的关键步骤和许多重要的细胞事件，如蛋白质磷酸化、基因表达、转录因子激活、DNA合成和细胞增殖[2，3.］．另一方面，ROS对细胞有毒，因为它们对细胞成分有损害。有人假设O₂-。粪便肠球菌等哺乳动物细菌病原体产生的毒素可能是一种毒性因子[4］．因此，细胞内对超氧化物介导的损伤的防御是强大的[5，6］．

对ROS的保护可能包括产生内源性酶，如过氧化氢酶，它降解H₂O₂超氧化物歧化酶(SOD)，它能使O₂-。［7］．

胰蛋白酶是一种丝氨酸蛋白酶，存在于许多脊椎动物的消化系统中，可水解蛋白质[8］．在我们之前的工作中，发现胰蛋白酶能清除O₂-。同时产生H₂O₂在细菌培养中。本文的目的是对这种O进行表征₂-。胰蛋白酶的清除活性，两者在活的有机体内而且体外。结果表明，胰蛋白酶的活性是独立的O₂-。清除生物中的酶。

方法

细菌

本研究中使用的大肠杆菌野生型菌株(MG1655)由伊利诺伊大学和厄巴纳分校微生物学系的James A. Imlay教授提供。菌株MG1655在LB培养基上37℃培养48小时，单菌落在LB液体培养基上再培养24小时，以获得每ml约109个细胞的悬液。该菌株保存在甘油中，-20℃保存直到使用。

胰岛素治疗

胰蛋白酶(牛，500单位/毫克结晶)从Amersco购买。胰蛋白酶(100毫克毫升^－1)加入O₂-。生产系统。37℃孵育30 min后，加入25 μl大豆胰蛋白酶抑制剂(10 mg ml^－1σ)。

超氧阴离子的定量测定

O₂-。是在VB₂(σ)的解决方案。O₂-。如Huycke所述，通过测量铁细胞色素c还原量来测量浓度[4]和Korshunov和Imlay [9］．

ESR谱。O的含量₂-。采用电子自旋共振(ESR)光谱法，用Tiron [10］．铁铁(1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸，Sigma)不仅是一种自由基清除剂，而且能与O₂-。形成半醌铁，ESR可通过四线一阶导数光谱检测到。Tiron自由基稳定，可用于O₂-。麦克雷和汤姆森所描述的生产[11]和李，等。[10］．采用Bruker ER 200 D ESR光谱仪进行ESR光谱分析。

过氧化氢生成测量

H₂O₂采用Seaver和Imlay报道的AR/HRP法检测含量[12］．

外部因素治疗

样品在0.5 mM Cu中孵育^{2 +}或25 mM EDTA 0.5小时或1 mM二乙基二硫代氨基甲酸乙酯(DDC)在28℃下1小时，按照Takahama等人描述的方法。[13］．

统计:采用SPSS for Windows 11.5进行统计分析。结果报告为均数±S.E.M.^{2 +}或DDC采用单向方差分析(ANOVA)确定。数值表示为显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)。

结果

胰蛋白酶对O₂-。在化学VB₂系统,在体外或在活的细菌培养中，在活的有机体内．

胰蛋白酶在不同体系中的清除活性

从三个或多个独立的ESR试验中获得的重复性结果表明，细菌细胞和VB₂系统产氧₂-。（图1B和1E)．在VB中单独的Tiron₂控制产生微弱的ESR信号(图1一个)．在Tiron存在的情况下，LB介质控制也产生了一个小的ESR信号(图1 d)．在我们之前的工作中，加入SOD(200单位ml)后，Tiron信号的振幅降低了95%以上^－1)，证实ESR谱是由O₂-。［10］．无论是细菌悬浮液还是VB₂胰蛋白酶(0.6 mg ml^－1)治疗(图1C和1F)．

胰蛋白酶浓度对清除活性的影响

在胰蛋白酶的存在，O₂-。同时观察到清除和过氧化氢的产生。当胰蛋白酶浓度低于0.4 mg/ml时，过氧化氢产量曲线与O₂-。清除。O₂-。保持稳定但缓慢增长的性能，而过氧化氢生产速率在0.4-1.0 mg/ml胰蛋白酶(图2)．运动常数，胰蛋白酶Km，清除O₂-。在37°C时，使用line weaver Burk图确定。胰蛋白酶呈现的km值为0.0618 mm，后续工作选择胰蛋白酶浓度为0.4 mg/mL。

初始超氧化物浓度对清除活性的影响

不同初始O的影响₂-。H和H浓度₂O₂进化和O₂-。测定清除能力。首字母O₂-。浓度为54.8 μM₂浓度为1.5 × 10-9 M₂细胞色素c测定系统。H₂O₂进化速率随O₂-。浓度由双倒数图确定(图3)．O的速率₂-。随着H的增加，清除率增加到0.103 μM/μg trypsin/min₂O₂产率最高可达0.00122 μM/μg胰蛋白酶/ min₂浓度为2.5⁶×10⁹米(图4)．O的曲线₂-。清除与H不一致₂O₂生产。H的比例₂O₂在产品中增加3-6 × 10⁹M VB₂而减少6.5-7.5 × 10⁹M VB₂．

外部因素对清除活性的影响

pH值对O₂-。测定胰蛋白酶的清除活性。结果表明，胰蛋白酶的最佳工作pH值为7.5-8.5。H的速率₂O₂胰蛋白酶/ O产生₂-。pH从5增加到10，反应逐渐减少6倍。O的速率₂-。从pH 5到6，清除率几乎翻了一番，相对于H₂O₂随着pH值从6增加到9，产率增加。随后的实验在pH 7.0下进行，以接近生理条件。

胰蛋白酶可被EDTA灭活。金属螯合剂25mm EDTA的加入显著抑制O₂-。胰蛋白酶的清除活性(图5) (p < 0.01)。用0.5 mM Cu进一步还原超氧阴离子^{2 +}在与胰蛋白酶反应中加入。加入1mm的DDC，铜的螯合剂^{2 +}， O₂-。清除活性(图5) (p < 0.01)。但超氧阴离子的浓度并没有恢复到原来的水平。DDC的效果显著弱于EDTA (p<0.05)。

讨论

我们确认了O₂-。胰蛋白酶在不同O₂-。生产系统，包括体外化学VB₂系统，以及体内活菌培养(图1)₂-。胰蛋白酶清除。在细菌培养，即生物浓度的超氧化物，胰蛋白酶可以表现出良好的O₂-。清除活性与内源性抗氧化剂，如SOD的存在。胰蛋白酶在生物学相关条件下可能是有效的和竞争性的。

在O反应中₂-。胰蛋白酶清除，H₂O₂被观察到是一个产物。O的速率₂-。扫气和H₂O₂胰蛋白酶或VB的浓度均影响其产量₂，表示首字母O₂-。浓度。胰蛋白酶的最佳浓度为0.4 mg/mL₂-。清除反应(图2)．在反应的初始阶段，H的速率₂O₂生产与O₂-。清除。VB时₂浓度为2.5⁶×10⁹M, H的比例₂O₂生产增加了。而当VB₂浓度超过6 × 10⁹M, H₂O₂产量大幅下降(图3)．研究了H₂O₂其背后的原理仍然未知。

结果表明，胰蛋白酶的最佳工作pH值为7.5-8.5。两个小时₂O₂生产和O₂-。酸性pH有利于清除活性(图4)．

在胰蛋白酶反应中，Cu^{2 +}是O₂-。清除。EDTA的加入显著抑制O₂-。胰蛋白酶的清除活性(图5)，证实该反应是由于与重金属的反应。铜对胰蛋白酶活性的促进作用^{2 +}证实铜^{2 +}在O₂-。胰蛋白酶的清除反应。DDC的加入显著抑制O₂-。清除活性(图5)，进一步验证了Cu^{2 +}是反应中的有效因子。EDTA和DDC抑制效果的差异表明，其他金属离子(如Ca^{2 +})可能参与胰蛋白酶的反应。考虑到EDTA或DDC的螯合都容易损害胰蛋白酶的活性，胰蛋白酶与铜离子的结合不能紧密。胰蛋白酶与钙离子之间的相互作用已被证实，而胰蛋白酶与铜离子之间的相互作用尚未明确。还需要进一步的工作。

与sod类似，胰蛋白酶可清除O₂-。可能是细胞防御O的组成部分₂-。压力。胰蛋白酶在胰脏中大量存在，而且很容易被纯化。因此，它被广泛应用于各种生物技术过程中。在蛋白质组学实验中，胰蛋白酶通常用于生物研究，将蛋白质消化成多肽，用于质谱分析，如凝胶消化。而在未来，胰蛋白酶可用于O₂-。在各种条件下的清除。

然而，关于O的作用机制还存在许多问题₂-。胰蛋白酶清除。在生物学相关条件下(即可能的超氧化物和蛋白质的生物浓度)胰蛋白酶是否与原生变性具有竞争力?如果答案是肯定的，那么接下来的问题是，这个过程是如何与各种SOD物种的催化作用竞争的?胰蛋白酶的这种作用是次要的还是主要的?目前尚不清楚在什么情况下胰蛋白酶可以作为SOD模拟物。这种反应可能发生在哪些生物系统中?迫切需要进一步的体内工作。说明胰蛋白酶清除超氧化物的新活性，将使我们对胰蛋白酶的抗氧化机制有一个新的认识，并对酶的机制有新的认识。

结论

胰蛋白酶被证实是O型₂-。清道夫。胰蛋白酶或初始O都可能影响清除活性₂-。浓度。研究了O₂-。胰蛋白酶的清除率为7.5-8.5。铜是这个反应中的一个有效因素。胰蛋白酶可能是一种潜在的抗氧化应激药物。

确认

我们要感谢James A. Imlay教授为这项工作提供菌株MG1655。超氧阴离子的测定在兰州大学仪器分析研究中心的支持下完成。国家自然科学基金(No. 31000017, U1404334)和中国博士后科学基金(No. 20110490150)资助。

利益冲突

作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献

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