蟹壳作为一种天然建筑的层次微观结构的认识

摘要

为了更好地了解中华大闸蟹壳的微观结构、组成和力学性能。为了充分揭示蟹壳的层次结构，利用电子显微镜在不同的放大倍数下，从不同的角度对蟹壳进行了观察。利用XRD、EDS、FTIR和TGA等技术对未经处理和化学处理的蟹壳进行了表征，为确定该生物材料的种类和相对含量提供了足够的信息。结合微观结构和成分分析，超越以往的报道，从不同的结构层面详细地了解了蟹壳的结构原理。为了探索结构与功能之间的关系，通过拉伸试验测量了壳体的力学性能。通过测定经HCl溶液处理的脱钙化试样的抗拉强度，探讨了壳中有机物和矿物对力学性能的影响。

关键字

节肢动物外骨骼，蟹壳，层次结构，力学性能。

介绍

大自然总是激励我们通过各种方式开发新技术或新材料，以满足世界进步过程中日益增长的需求。1]。研究生物材料是人类获取多功能人造材料设计智慧的有效策略。生物材料在进化过程中经过长期的选择和进化过程，在结构和成分上进行了优化，因此具有比具有相同成分的合成材料所能达到的优异性能(如机械性能)[2，3.]。节肢动物的外骨骼，如龙虾角质层和蟹壳，由于其复杂的层次结构而成为最引人注目的生物材料之一。这种材料通常被认为是由一层薄薄的蜡状表皮层作为防水屏障，主要结构部分(产品)设计用于抵抗机械载荷[4，5]。根据以往的研究[6，7]，微结构明确的产品按5个结构层次逐步构建:从原纤维，到纤维，到纤维束，到平面，最后到扭曲胶合板结构。遗憾的是，在这些现有的报道中，对节肢动物角质层微观结构的许多细节并没有详细阐述，这确实阻碍了对其构象的进一步了解。另一方面，据报道，该生物材料的化学成分主要包括长链多糖、几丁质、蛋白质和方解石或无定形碳酸钙[8-10]。然而，到目前为止，很少有研究涉及到这些成分是如何构建这种材料的层次结构的[11]。节肢动物的多层外骨骼由于其复杂性，至今尚未得到充分的认识，因此同步研究其结构和化学成分对于探索其结构组织是非常必要的。

多功能节肢动物的外骨骼不仅具有环保和抗干燥的功能，而且还能支撑身体，抵抗机械载荷[12-14]。虾外骨骼和蟹壳的优异力学性能是Joffe和Hepburn于1975年首次发现的[15，16]。Melnick等人后来报道了蟹螯的硬度和韧性，并指出材料中的深色区域比浅色区域表现出更好的机械强度[17]。最近，Raabe等人研究了微观结构对龙虾角质层力学性能的影响。也) ［18-20.]。众所周知，微观结构和构件的力学意义对于揭示结构-性能关系至关重要[21，22]。遗憾的是，很少有研究人员能够区分不同成分对节肢动物外骨骼力学性能的贡献。

在本研究中，对壳的组织构象和力学性能进行了研究中国的毛通过探测微观结构，分析化学成分和进行拉伸测试实验，对螃蟹进行了仔细研究。本研究旨在了解结构组织与力学性能之间的关系。这项研究的另一个动机是揭示大自然如何利用相对较弱的成分(几丁质、蛋白质和碳酸盐)创造出坚固而坚韧的材料的机制。

材料与方法

未经处理和处理过的蟹壳

未经处理的中国的毛螃蟹来自苏州阳澄湖湖畔的当地餐馆。湿漉漉的新鲜贝壳(图1)被人从生命中剥了下来中国大闸蟹，用去离子水冲洗几次，然后保存在水中待使用。干燥样品由湿样品在相对湿度~40%的条件下风干24 h制得。

为了获得经过化学处理的样品，新鲜的蟹壳碎片在5wt % NaOH中回流6小时，在剧烈搅拌下去除大部分蛋白质，和/或在室温下用7% HCl溶液处理给定时间，以去除矿物盐[23]。

特性和测试

用金电极溅射后，用场发射扫描电子显微镜(FESEM, S-4800, Hitachi Co.， Japan)观察蟹壳的形貌，并用富士数码相机(FUJIFILM digital Camera, S2000HD)拍摄照片。在环境扫描电子显微镜(ESEM, XL-30, Philips Co.，荷兰)上安装Kevex EDX探测器(Thermo Co.，美国)，测量未包金处理样品的定性能量色散x射线(EDX)光谱。x射线衍射仪(XRD, AXS D8 ADVANCE, Brucker, Germany)在电压为40 kV，电流为40 mA的Cu环境下工作，记录了x射线衍射图Kα2θ范围为10 ~ 80°的辐射，步长为0.04°，每次计数时间为1 s。KBr球团样品的FTIR光谱采用Cary 670 Spectrum (Varian Co.， USA)在400-4000 cm范围内进行¹。热重分析(TGA, Pyris 1, PerkinElmer Co.， USA)在室温至950°C的加热范围内进行。封闭室内的相对湿度由三台干燥机(日本三菱公司)控制。利用软件3ds max®7(Autodesk, Inc.)绘制了蟹壳分层结构的三维仿真模型。试样的应力应变曲线由拉伸试验机(中国华龙仪器厂，WDW-5)生成。

结果

微观结构

壳的中国的毛首先用FESEM技术对螃蟹的横截面进行观察，代表性图像见图1 gydF4y2Ba。显然从图1一个，蟹壳总厚度约550μM由外至内由上皮、表皮和胚珠组成。最外层上皮视为~10μ电镜下观察，约70的表皮下的M薄膜呈裂纹和卷曲状μM的厚度被紧密的粒子压实(图S1)。残段定义为产品(约470μM)成为蟹壳的主要结构部位，是本工作的主要研究对象。产品具有明显的胶合板(布利甘)结构，进一步分为外表皮(外表皮)、图1b和1c)及内纸(内、图1d和1e)。在外表皮，可以发现许多细长的纤维图1b和1c不同于内窥镜的特征。比较图1b带1d，可以看出外表皮的板层高度(6.0μM)比内腔(6.6)略小μm).近距离观察胶合板结构(图1)表明该平面由宽度为1.0 ~ 1.5 μm的自捻纤维束组成，相邻纤维束之间的一些通道穿透了胶合板层。在每个束中，~90 nm的纤维以螺旋形堆叠，并在z方向上完成180°旋转，形成水平面，如图中的3D模型所示图1 g。此外，有趣的是，它是从图1 h和图S2束中的纤维实际上是一簇平行排列的原纤维(直径40纳米)，形成一个30纳米空心核的管。

值得注意的是，许多椭圆型细胞孔的尺寸约为1 × 0.5μM是从产品的俯视图披露的(图2)，其面积与整个壳面之比约为0.15。在图2 b结果表明，沿椭圆孔长轴平行排列的纤维形成了直径约1.2 μm的细胞壁。仔细检测到细胞毛孔的边缘(图2)文件显示，在法线方向堆叠的光纤下出现以线条标记的扇形辐射，并用软件3ds max®进一步模拟(图2 d)。斜视消失了图2 e同时显示自捻纤维束和椭圆型细胞孔，其中细胞孔显示从侧面观察到的孔管形态。如图2 f，相邻胶合板平面上的运河相互连接，并在内部连接形成长运河。此外，一些柔软的长带状结构以螺旋的方式扭曲在长沟渠中，其与沟渠的比例约为0.5。

图3给出了蟹壳粉的归一化x射线衍射谱。在该模式中，首先在19.4°、20.5°和23.2°处发现三个宽衍射峰，这是α-几丁质晶体的典型特征[23]。在2θ=29.6、36.2、39.6、43.4、47.7、48.8、57.8、61.2、65.1°处的一组衍射峰可以被标记为高晶方解石CaCO_3.，分别对应104、110、113、202、018、116、122、214、300架飞机(JCPDS卡号:05 - 0586)。(104)平面的衍射信号比其他平面强得多，表明方解石沿生物聚合物链结晶。此外，在这种模式中还发现了一些模糊和未知的条带，这意味着壳中存在非晶态成分。

化学处理材料

壳的中国的毛将蟹粉碎成约4 × 4 cm大小的碎片，用NaOH(6小时)或HCl(24小时)溶液处理，得到脱蛋白或脱钙样品。未经处理和化学处理的材料分别用EDX, FTIR, TGA和FESEM技术进行监测。图4一给出了所有样品未经镀金处理的EDX光谱。未经处理的壳中，C、O和Ca元素的信号峰非常强，而N、Na、Mg、P和Cl元素的信号信号相对较弱。naoh处理后样品的C、N、P峰强度明显减弱，而盐酸处理后样品的C、O、Ca元素信号较低。NaOH和HCl溶液先后处理后的样品仅呈现出减弱的C和O峰。

未经处理和化学处理的材料的FTIR光谱记录在400-4000 cm范围内¹，结果见图4 b。首先对未经处理的贝壳进行光谱分析，估计其主要成分:3300-3500 cm范围内的波段¹被认为代表羟基，特征峰在1662 cm¹表示酰胺基团(-NHCO拉伸)，暗示蛋白质的存在。峰在711,870和1430厘米处¹可归因于co3.2 -源自CaCO_3.［24]。酰胺II带在1550 cm处¹和NH伸展带在3272 cm处¹［23]，尤其是无水α-几丁质。naoh处理后的生物材料在3272 (-OH)和1662 cm处呈现弱吸光度¹(-NHCO)是由于蛋白质的去除，而那些属于CO的条带_3.在盐酸处理样品的光谱中被还原甚至消失。氢氧化钠/盐酸处理后的壳在其光谱中只显示几丁质的特征带。

图4 c显示未处理和处理样品的热重分析(TGA)曲线，温度从25°C增加到900°C。为避免水分在TGA分析过程中的干扰，所有样品均在相对湿度低于30%的条件下进行绝对干燥分析。未处理样品在87°C左右的曲线上发现第一个质量减少，在naoh处理(去蛋白)蟹壳的曲线上看不到，表明蛋白质的分解。在接近687°C时，另一个明显的固体质量降低曲线应该是由于CaCO的脱羧作用_3.［19]，因为这种损失不会出现在盐酸处理样品的曲线中。此外，在260~550°C范围内，所有的曲线都有明显的重量下降，这可能是由于几丁质成分的降解[25]。

未处理和处理过的壳的俯视图形态见图5。未经处理的生物材料明显地公开了由表面光滑的交叉纤维束制成的定义良好的多孔结构(图5)。在图5 b在脱蛋白的纤维束表面发现许多不规则的颗粒或结节。显然，壳碎片被盐酸脱矿了(图5)主要由直径约40 nm的无框纤维和软纤维组成，比未处理样品中的纤维细(约90 nm)。图1 h)。如图所示图5 d，氢氧化钠/盐酸处理的材料只显示出直径约20纳米、长度约数百纳米的熔融纳米纤维。

力学性能

拉伸试验采用沿头尾线从湿蟹壳和干蟹壳上剪出条状碎片，原始长度约4.0 cm，宽度约1.0 cm。测试时，将壳条一端固定在机器上，另一端在测量时由步进电机缓慢拉伸。每100ms自动记录拉力和位移，然后分别转换为应力和应变数据。干、湿两种工况下的典型壳应力应变曲线如图所示图6,表1总结了拉伸试验中相应的特征力学数据。

表1:蟹壳纵向拉伸试验的力学性能。

湿试样的平均极限抗拉强度为51.2±7.7 MPa，平均应变至断裂为3.16±0.45%;干试样的平均极限抗拉强度为37.8±5.6 MPa，平均应变至断裂为2.23±0.35%。杨氏模量是通过取1.5%应变后的数据点和线性拟合来测量的。湿试样的杨氏模量平均值为1158±85 MPa，而干试样的杨氏模量平均值为1918±132 MPa。用应力应变曲线下面积测量的断裂功或韧性受到逐渐断裂的显著影响。湿态试样的韧性为0.79±0.18 MPa，是干态试样(0.41±0.09 MPa)的2倍左右。

对与蟹头尾线夹角不同的湿壳条进行了拉伸试验，其极限抗拉强度和平均断裂应变见图7。当夹角在壳面0 ~ 22.5°、45°、67.5°、90°、112.5°、135°、157.5°范围内变化时，蟹壳的极限抗拉强度相对均匀(~50 MPa)，而随夹角变化，带材的平均应变在1.8 ~ 4.4%之间波动。用HCl溶液处理4 × 1 cm的壳条，揭示了脱矿时间对壳条碳酸盐含量和极限抗拉强度的影响图7 b。结果表明，在处理前4.5 h，贝壳碳酸盐含量由32.02线性下降至8.64%。2 h后，随着处理时间的延长，材料中碳酸盐含量的下降速度从5.85%放缓至3.53%。对于脱矿过程中拉伸性能的演化，应力- dt曲线表现为两个明显的衰竭阶段。钢带强度第一次下降发生在处理0~0.5 h，由51.24 MPa迅速下降到31.83 MPa。应力曲线经过平缓阶段后，在脱矿时间3~4.5 h出现第二次衰竭，抗拉强度由29.5 MPa降至20.28 MPa。随后，壳条应力缓慢下降，处理12小时后达到18.51 MPa，碳酸盐含量约为3.53%。

讨论

结构组织

本文通过对蟹壳的形态学观察，对节肢动物外骨骼的微观结构有了新的认识。贝壳的最外层上皮中国的毛螃蟹因其易碎的特性而被认为是由有机基质构成的，在以往的研究中很少被提及。蜡质表皮通常被称为外部层和对环境的渗透性屏障[11，19]。表皮下是表皮的主要结构部分，主要用于抵抗机械载荷[26]。在蟹壳的外表皮中发现了许多细长的纤维，这与其他报道(Guiraud-Guille et al.)一致。与已有报道的节肢动物外骨骼不同，外皮和内膜胶合板厚度差异较大中国的毛蟹壳(~0.5μM)比那些(bbbb10)小得多μM)其他蟹壳及龙虾角质层[20.，22]。此外，本文还首次发现了由纳米原纤维组装而成的中空原纤维簇。带状结构:带状结构图2 f实际上是用来运输蟹壳生长所需的营养物质的孔管[10，18]。每立方米应该有1.7 × 1011个小管²为了壳中国的毛螃蟹，这接近于其他螃蟹的高密度小管[22，22]。仅观察到少量孔管的原因图2一个这些有机电子管经常被高能电子束破坏。

有趣的是，这些蟹壳的侧面图像(图1)展示胶合板结构，同时从同一外壳的俯视图中观察多孔结构(图2)。尽管两种不同的形态可以被其他研究人员引用，但由于节肢动物外骨骼的复杂性，它们的统一性迄今尚未得到很好的理解。在此，我们试图巩固胶合板和多孔结构，描绘真实的蟹壳微观结构。由此推测，椭圆型细胞孔见于图2一个是由观察到的纤维束相交而形成的图1 f，通过以下几个例子证明了这一点:首先，束的宽度(1.0-1.5μM)与细胞壁(~1.2)一致μm).其次，下伏堆叠光纤的扇形辐射(图2)提示多孔结构表面下纤维平面的旋转。第三，斜视图像图2 e同时呈现胶合板层和多孔结构。更重要的是，3D模型给出了吗图2 d预测了一种可能性，即细胞孔可能确实是由这些网状的交叉纤维束构成的。

用XRD、EDS、FTIR和TGA等分析了蟹壳的化学成分。XRD结果表明，天然蟹壳是至少含有α-几丁质晶体的复合物，方解石沿生物聚合物链结晶。然后，用强碱或酸性溶液对蟹壳片进行化学处理，去除酸性有机物或矿物盐[23]。NaOH溶液处理后的样品显示出低含量的C、N、P元素(表S1)以及羟基和酰胺基团的弱吸收带(图4 b)，表明原始生物材料中存在蛋白质[18，26，28]。矿物碳酸钙的存在₄和几丁质分别被EDS和FTIR结果证实。总之，蟹壳的主要成分应该是蛋白质、碳酸盐和几丁质。由于蛋白质、几丁质和碳酸钙的热降解温度_3.分别为87°C、260°C和687°C(图4 c)，初步估算其在天然生物材料中的相对含量为:蛋白质5.17%，甲壳素24.60%，CaCO 32.02%_3.，其他38.21%(表2)。

表2:用热重分析仪测定了生蟹壳中主要成分的相对含量。

为了深入了解节肢动物外骨骼的生长原理，研究了节肢动物外壳的结构组织中国的毛在上述研究的基础上，从下向上分析螃蟹:在分子水平上，几种长链多糖几丁质以反平行的方式排列，产生长度为数百纳米的较薄原纤维形式的α-几丁质晶体[26]。这些几丁质原纤维被蛋白质和其他有机物包裹并结合在一起，形成有机纳米纤维。这些有机纳米纤维链作为基质进一步嵌入以结晶碳酸钙为主的矿物中_3.，形成矿物包覆复合纤维(~40 nm)，可见于图1 h［23]。在这个例子中，有机纤维上的矿物质涂层可以通过生物聚合物蛋白质的溶解导致一些矿物纳米颗粒从复合纤维上剥落这一事实来证明(图4 b)。然后，这些复杂的纤维沿着它们的轴线平行排列，形成中空纤维团，如图所示图1 h和图S2。随后，这些纤维团簇在正常方向上堆叠，形成大束，并以螺旋形180°旋转(图1)。此外，许多扭曲的纤维束作为构建块相互相交，形成了在节肢动物外骨骼中广泛发现的二维胶合板平面，从俯视图来看，显示出多孔表面。最后，称为Bouligand结构的胶合板层反复叠加，并与碳酸盐盐粘附形成多层外壳[19，20.]。

力学性能

利用蟹壳的力学特性来了解结构组织在荷载作用下的作用。从图中看到的凹形应力应变图6表示蟹壳的塑性变形[18]。与以往报道的泥壳和羊蟹壳的极限抗拉强度和杨氏模量进行了比较中国的毛无论是湿样品还是干样品，螃蟹的含量都非常高，这可能是由于无机矿物质含量较高和生物材料的连锁微观结构[27，29]。然而,中国的毛由于几丁质蛋白基质含量相对较低，蟹壳(干蟹壳和湿蟹壳)的平均断裂应变和韧性均低于其他蟹壳[22]。在壳面改变拉伸方向时，极限抗拉强度随变形能力的差异变化不大(图7a)，这可以解释为蟹角质层的扭曲胶合板结构产生了各向同性的拉伸特性[19]。

通过分析抗拉强度与钙含量的关系，探讨了壳中矿物质对拉伸性能的贡献(图7 b)。钙含量在HCl处理初期呈线性下降，主要原因是连接胶合板大裂缝的碳酸盐的溶解(图2)暴露在酸溶液中。在这种情况下，如果应力施加到这种处理过的条带上，胶合板层就会由于矿物质的节合力不足而发生错位[30.]，从而在处理0~0.5小时时使壳条抗拉强度降低(图7 b)。当平面之间的矿物质耗尽时，由于无机酸在多孔材料中的有限扩散，包覆在有机纤维上的内部碳酸盐开始缓慢反应[31]，从而导致钙盐的延迟释放。当沿着蛋白质-几丁质纤维的矿物质的连续性被反应破坏时[21]时，碳酸钙对抗拉强度的贡献将被忽略，对应于应力曲线的第二次衰竭。最终的拉应力(18.5 MPa)应主要归因于有机纤维，其中碳酸盐含量很低(3.53%)。据此，碳酸钙对拉伸强度的贡献估计为32.7 MPa。这种测试不同组分对拉伸强度贡献的方法对于材料科学家实现天然复合材料的设计和力学性能，开发具有增强功能的新型复合材料非常重要。

结论

从这个作品中得出的结论是中国的毛螃蟹具有层次分明的结构组织和优异的力学性能。从蟹壳的侧面照片中看到的胶合板建筑与从俯视图中观察到的多孔结构首次结合在一起。对蟹壳的化学分析表明，该生物材料由5.17%的蛋白质、24.60%的结晶几丁质、32.02%的结晶CaCO3和38.21%的其他物质组成。壳的结构组织由下而上依次为:几丁质结晶原纤维、有机/矿物纤维、中空纤维团、扭曲纤维束、胶合板面、多层壳。壳的中国的毛与其他蟹壳相比，蟹壳具有优良的杨氏模量和极限抗拉强度，且与壳面拉伸方向无关。对脱钙样品的测试表明，蟹壳中矿物和有机纤维对抗拉强度的贡献分别为32.7和18.5 MPa，这是研究蟹壳力学性能与组分关系的第一个途径。了解天然复合材料的设计和力学性能，对开发具有增强功能的新型复合材料具有十分重要的意义。

致谢

国家自然科学基金(21104093、21073156、21273004)资助。

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