油棕单形微卫星标记的应用。

摘要

分子标记在油棕的特性和育种上始于20年前。微卫星标记系统自开发以来，一直被广泛应用于油棕研究。单型SSR标记由于缺乏遗传变异性，已被研究人员从所有的进化和群体遗传学研究中淘汰。本研究的目的是回顾多态DNA微卫星标记系统，即简单序列重复序列(SSR)在油棕研究中的发展历程，并利用单态SSR标记检测油棕育种中的不合法性。本研究使用了10个单型SSR标记和2个半兄妹家系。在家族1和家族2中通过4个单胚位点megcir0425、mEgCIR3477、mEgCIR3769和mEgCIR3902发现了非亲本id 97和180。此外，5个基因座(mEgCIR3574, mEgCIR3607, mEgCIR3672, mEgCIR3785和mEgCIR3807)检测到一个非法后代ID 180。本研究表明，单态SSR标记适用于油棕育种中私生代的检测。

关键字

单形，油棕，多态，简单序列重复

介绍

油棕是一种多年生油料作物，二倍体有16对染色体，分为两种，Elaeisguineensis和Elaeisoleifera根据它们的原产地，它们也被称为非洲和美洲油棕榈。美国的品种是有吸引力的，因为它具有许多良好的特征，如高度缓慢增长和抗病[1]。因此，油麻用于杂交大肠guineensis将其有用特性转化为商业材料。的大肠guineensis是商业油棕的原料来源，油棕最重要的产油类型是什么tenera的结果硬脑膜×pisifera(D×P)十字架。油棕属于槟榔科(棕榈科)，是仅次于禾本科(禾本科)的第二大经济重要的单子叶科。Dransfield的最新分类等。[2]为棕榈科，槟榔科共187属，包括Elaeis。

由于过去50年来对马来西亚经济的重要贡献，油棕获得了许多不同的名字，如“经济作物”或“黄金作物”。2011年，马来西亚和印尼棕榈油产量分别达到18912万吨和214.49亿吨;而世界总量为477.04亿吨。这种经济增长是由农业部进行研究和开发(R&D)的结果，并通过许多组织，如马来西亚棕榈油研究所(PORIM)，直到马来西亚棕榈油委员会(MPOB)的成立。现在，研发已经扩展到食品、营养、油脂化学产品、基因组学、生物技术和生物燃料等多个领域。油棕研发在育种项目上有很好的组织，以提高产量为第一要务，其次是油的质量和棕榈树的抗病能力。育种研究和种植面积的扩大导致了产量和产量的增加。这些增加的主要原因是育种工作导致的遗传物质的变化。从旧种植材料的转换硬脑膜到tenera(D × P)杂交种子为第一步增产30%，第二步提高单位面积生产力，[4]报道下一步增产将采用无性系种植材料。此外，生物技术，特别是分子标记在油棕遗传研究中发挥着重要作用。在过去的20年里，分子标记已被应用于油棕研究，如使用限制性片段长度多态性(RFLP)[5]进行DNA指纹识别，通过实施随机扩增多态性DNA (RAPD)[6]和扩增片段长度多态性(AFLP)[7]进行遗传多样性，以及使用微卫星[8]进行QTL定位。每一种DNA标记类型都有其优缺点，但单位点DNA微卫星标记系统(SSR)因其具有多态信息含量、可重复性、共显性、在基因组中广泛分布和丰度等优点，是油棕研究中应用最广泛的DNA标记。微卫星在油棕中很常见，可用于各种遗传研究(表1)。Billotte等。[9]报道了第一个从油棕中富集的DNA文库中成功开发SSRs，阳性克隆的比例很高。自这些标记开发以来，它们已被广泛用于油棕研究。表2.2显示了在对油棕进行的许多研究中使用SSRs标记。本文综述了近年来在油棕中应用ssr标记的研究进展，并对其意义进行了综述。ssr的来源可以是富集的DNA文库，也可以是EST-SSR。发现了19项使用SSR标记的研究。11项研究使用了基因组SSR, 5项研究使用了EST-SSR，只有3项研究使用了它们的组合。基因组ssr通常用于遗传多样性和QTL定位研究。EST-SSRs主要用于遗传多样性研究，有助于检测种质间的遗传变异。此外,Tranbarger等.[10]提示来自cDNA的EST-SSRs可用于功能多样性研究。遗传多样性研究中ssr的数量在9 ~ 21个之间。在QTL定位中，使用的ssr数量在22 ~ 371个之间，但在所有的QTL研究中，都使用了ssr与其他标记系统的组合。在廷的研究中等.[11]的最终图谱中SSRs标记的数量少于其他qtl工作中的标记数量，但他们证明了由于油棕的大基因组大小，他们的亲本图谱不饱和。在另一项混合验证的研究中，他们使用了9个SSRs[12]。近年来，ssr被应用于关联研究，作为油棕抗病性的筛选工具灵芝在一个育种计划中，用于油棕半兄弟姐妹家庭的私生子测试和兄弟姐妹分配[13]。

上述研究在油棕研究中使用了多态ssr。然而，在本研究中，我们使用单形ssr来检测油棕育种计划中的非法棕榈。

材料与方法

植物材料和DNA提取

从对照杂交D × P (硬脑膜×pisifera)。每个家族有50个后代，FP1/10和FP1/28是兄弟姐妹，男性父母(pisifera)和硬脑膜Family-2 (FD6 × FP1/10)和Family-4 (FD1/224 × FP1/28)果型分别为FD6和FD1/224。

采用改良的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)方法[27]提取幼苗和亲本叶片基因组DNA。在1%琼脂糖凝胶中进行凝胶电泳检测DNA质量，使用NanoDrop H ND-1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc)测量浓度并检查提取DNA的数量。

微卫星基因分型

在所有后代上共检测了9个单胚微卫星位点。表2提供有关这些位点的信息。在15 μL体积，含50 ng DNA, 1×PCR buffer (-MgCl₂)， 0.2 mMd NTP mix, 0.2 UTaq聚合酶(Invitrogen，巴西)，2.0 mM MgCl₂、0.2 ug/μL BSA、0.3 mM M13尾正向引物、0.3 mM无尾反向引物和005 mM IR700或IR800 ird标记M13引物。PCR在My Cycler Thermal Cycler (Bio Rad)上进行，95°C初始变性3分钟，95°C变性35次30秒，52°C退火1分钟，72°C延伸2分钟，72°C最终延伸15分钟。所有正向引物均以M13 5 ' - gga AAC AGC TAT GAC CAT- 3 '结尾，允许IRD标记的M13引物[26]同时扩增PCR产物。

微卫星基因分型采用LI-COR 4300 DNA分析系统(LI-COR BioScience, Lincoln, NE, USA)进行。将标记的PCR产物IR700或IR800混合，然后在6.5% KB Plus丙烯酰胺凝胶基质(LI-COR Inc.)中分离。使用SAGA Generation 2软件(LI-COR Inc.)对等位基因大小进行检测和评分，每个凝胶中有三个大小为50-350 bp的标准(LI-COR Inc.)。

结果与讨论

对LI-COR凝胶进行了10个单形位点的人工分析(表2)在两个同父异母兄妹家系中进行基因分型。在[13]的前期工作中，他们利用多态ssr标记分别在Family-2和Family-4中检测到两个非法棕榈id 97和180。图1为Family-2和Family-4单形位点mEgCIR0425的凝胶图。例如，在这个位点上，Family-2的所有后代都只有一个等位基因，而ID 97的后代有两个等位基因。

在Family-4中，所有后代都有两个等位基因，但ID 180的后代有两个不同的等位基因。在family -1和Family-2的mEgCIR3477、mEgCIR3769和mEgCIR3902位点也发现了类似的结果。这些结果表明，家族-2和家族-4的后代id 97和180与其他后代的等位基因不同。因此，这些后代是非法的，不属于任何类型的家庭。本研究结果与[13]的研究结果一致，[13]通过多态SSR标记和计算分析发现Family-2和family -4的后代id 97和180为非法。

另外，5个单态位点(mEgCIR3574、mEgCIR3607、mEgCIR3672、mEgCIR3785和mEgCIR3807)仅检测到1个非合法子代ID 180，未检测到非合法子代ID 97。根据[13]的研究，其后代ID 97是由于对照杂交期间花粉污染造成的。相比之下，混杂的(非法的)后代ID 180可能是由育婴阶段的错误造成的。这一错误可能是由于幼儿阶段的错误标记。而单形位点megcir3722未检测到非法后代ID 97和ID 180。本研究表明，单态SSR标记可用于油棕育种的非法性检测。

此外，[28]的前期工作报告了单形SSR标记对遗传分析有用，[29]报告了将单形微卫星标记转化为多态性标记。本文还成功地研究了单形微卫星标记向多态标记的转化。Gossypiuml .)。

结论

总之，这一重要发现满足了本研究的目标。由于单形SSR标记在育种计划中成功检测到非法棕榈树，本研究表明单形分子标记也适用于油棕的非法检测。

确认

作者感谢FELDA农业服务Sdn提供的支持。有限公司以及发表这篇文章的许可。我们感谢FELDA生物技术中心的工作人员，特别是Sharifah Shahrul Rabiah Syed Alwee博士对项目的所有投入和讨论。

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