高效液相色谱法同时测定原料药和制剂中西格列汀和盐酸二甲双胍含量。

摘要

简单、精确、准确、快速高效薄层色谱建立并验证了同时测定西格列汀和盐酸二甲双胍两种抗糖尿病药物的方法片剂剂型。以甲醇:氨:冰醋酸(9.4:0.4:0.2 v/v/v)为介质，在硅胶60F254预涂薄层色谱板上进行研究流动相。在214 nm处使用薄层扫描仪在吸收模式下对色谱图进行直接评价。方法按ICH指南进行验证。的相关系数西格列汀和二甲双胍在100-1100和1000-11000 ng带1浓度范围内的校正曲线分别为0.999和0.998。该方法对西格列汀和盐酸二甲双胍的精密度分别为99.70%和100.02%。两种分析物的日内和日间精密度以变异系数测量均小于2%。西格列汀的检测限和定量限分别为7.08 ng band 1和21.82 ng band 1，盐酸二甲双胍的检测限和定量限分别为19.31 ng band 1和58.51 ng band 1。该方法可以在不受片剂辅料干扰的情况下，从剂型上同时测定这些药物

关键字

西格列汀，盐酸二甲双胍，HPTLC，密度测定，验证。

简介

Sitagliptin(STG)，(2R)-1-(2,4,5-三氟苯基)- 4-氧氧-4-[3-(三氟甲基)- 5,6二氢[1,2,4]三唑[4,3-a]吡嗪-7 (8H)-基]丁烷-2-胺(图1二肽基肽酶- iv (DPP-IV)口服有效选择性抑制剂，已在美国、欧洲和其他国家上市，用于治疗2型糖尿病。DPP-IV抑制剂提高活性胰高血糖素样肽1 (GLP-1)和其他肠促素水平，促进葡萄糖依赖性胰岛素分泌[1]。

二甲双胍(遇到)(N, N-dimethylbiguanide) (图1)，最初由Bristol- Myers Squibb销售的Glucophage TM，现在有许多通用配方。二甲双胍是治疗糖尿病的一种双胍型胰岛素增敏药物。该药物的作用模式是通过激活腺苷单磷酸活化蛋白激酶(AMPK)，这是一种肝脏酶，在胰岛素信号、全身能量平衡以及葡萄糖和脂肪代谢中发挥重要作用。AMPK的激活对肝细胞产生葡萄糖产生抑制作用。二甲双胍是世界上处方最多的抗糖尿病药物，是治疗II型糖尿病的主要一线疗法[2]。

经过全面的文献调查，鲜有报道同时估计STG和MET药品剂型和生物液体，包括紫外分光光度法[3.-5),rp -［6-8]， uplc [9]，以及激光二极管热解吸串联质谱法[10]。但是，目前还没有报道用HPTLC方法同时测定STG和MET的联合剂型。本研究描述了一种简单、灵敏、准确的HPTLC方法，用于从联合剂型中估计STG和MET的含量。

实验

材料

研究中使用了STG (Merck Private Ltd.， Mumbai, Maharashtra, India)和MET (briosiprivate Ltd.， Jejuri, Maharashtra, India)的分析纯样品。本研究中使用的药物剂型为JANUMET(Merck Sharp and Dohme, MND Holland, Netherlands)，从当地市场采购，并标明每片含有50 mg STG和500 mg MET。在研究中使用的溶剂和化学品是AR级(研究实验室。，纳西克，马哈拉施特拉邦，印度)。

仪表

微注射器(Linomat注射器659.004,Hamilton-BonaduzSchweiz, Camag，瑞士)，预涂硅胶60 f -254铝板(10 ×10 cm，厚度250 μm;默克，德国)，Linomat 5滴药器(Camag, Muttenz，瑞士)，双槽室(20 × 10厘米;本研究使用了Camag, Muttenz,Switzerland)、饱和垫(Camag, Muttenz,Switzerland)、UV室(Camag, Muttenz,Switzerland)、TLC扫描仪iii (Camag, Muttenz,Switzerland)、winCATS version 1.3.0软件(Camag, Muttenz,Switzerland)。微软excel也用于统计处理数据。

标准溶液的制备

将10mg STG和110mg MET分别溶解在10ml甲醇中，得到浓度分别为1000 μg/ ml的STG和11000 μg/ ml的MET的标准原液。用甲醇适当稀释标准原液，得到STG和MET的工作标准溶液。

样品溶液的制备

称量20片(JANUMET，标签上标明每片含有50毫克STGand 500毫克MET, Merck Sharp and Dohme, MND Holland, Netherlands)，粉碎成细粉。精确称量相当于50 mg stg的粉末样品，转移到20 ml的量瓶中，用甲醇制成约10 ml的体积。超声约20分钟，用相同溶剂稀释至体积，用42号What manfilter paper过滤。用甲醇稀释适当体积的原样溶液，新鲜制备工作样品溶液。

优化色谱条件

取适当体积的标准溶液和样品溶液(μl)分别在距HPTLC板底8mm处和距边沿8mm处以条带或条纹的形式涂于板上，条带长度为8mm。流动相为甲醇:氨:冰醋酸(9.4:0.4:0.2 v/v/v)。采用双槽室提升展开技术。优化的流动相饱和时间为室温(25±2℃)下的20 min，并辅以饱和垫。溶剂面覆盖距离为80 mm，耗时约15 min。在214 nm的吸光度模式下，使用TLC扫描仪3扫描斑点，所有测量均由win CATS软件操作。从吸收光的强度和峰面积来确定分离化合物的浓度。

上市配方分析

按上述方法制备片剂样品溶液。制备STG和MET浓度比为1:10 (500 ng: 5000 ng STG和MET)的合适工作样品溶液(1μl)，应用于HPTLC板上，在优化的色谱条件下进行分析。

HPTLC方法的验证[11，12)线性

通过对STG和MET分别在100-1100 ng -1和1000-11000 ng -1的浓度范围内进行三次重复测量，评估了药物峰面积与浓度在ng -1的浓度范围内的线性关系。

精度

通过重复性和中间精密度研究，研究了所开发方法的精密度。样品的应用和峰面积的测量是通过使用含有900 ng带1的STG和9000 ng带1的MET的样品溶液对同一波段进行6次重复测量来确定的。

恢复的研究

通过向药品中加入三种不同已知量的标准物质(标准添加法)进行回收研究。因此，在样品稀释后，将200、250和300 ng band-1的STG和2000、2500和3000 ng band-1的MET分别加到含有250和2500 ng band-1的STG和MET的剂型中。

检测限度(LOD)和定量限(LOQ)

由STG和MET的校正曲线截距标准差和斜率计算出所建立方法的检出限和定量限，计算公式如下:

检测限= 3.3 à ¥/B

定量限= 10 à ¥/B

其中N是y截距的标准差，B是校准曲线的斜率。

特异性

测定STG和MET的峰纯度以评价方法的特异性。样品和标准带分别在峰值起始(S)和峰值结束(E)位置进行扫描。本研究分别采用STG和MET标准原液(分别为1000μg/ml和1100 μg/ml)。

结果与讨论

上市配方分析

采用所开发的方法对已上市的配方JANUMET进行了分析。STG和MET在Rf值分别为0.61和0.28时只有两个峰，说明片剂配方中不存在辅料的干扰。将样品峰面积与标准品峰面积进行比较，计算STG和MET的含量。表1)．片剂配方的密度图见图3。

HPTLC方法优化

为了有效分离STG和MET，使用含有不同极性、不同浓度溶剂的流动相进行了几次运行。在不同的流动相组合中，以甲醇:氨:冰醋酸(9.4:0.4:0.2 v/v/v)为流动相的STG和MET的分辨率最佳，峰清晰，Rf值分别为0.61±0.02和0.28±0.02。在HPTLC仪器上扫描涂在硅胶上的标准点，获得其重叠光谱，以选择药物定量的分析波长。从重叠光谱(图2)，观察到STG和MET在214 nm左右均表现出较强的吸光度，并选择该波长作为进一步分析波长。

方法验证线性

峰面积与浓度呈较好的线性关系，峰高与浓度呈较好的线性关系。STG的r2为0.999,MET的r2为0.998。STG在100 - 1100ng band-1浓度范围内，MET在1000-11000ng band-1浓度范围内构建校准图。计算了两种药物的相关系数、y截距和回归线斜率，并在表2。

精度

该方法的重复性和中间精密度以峰面积的相对标准偏差(RSD)表示。结果表明:STG浓度为900 ng band-1时，met浓度为9000 ng band-1时，测定结果的重复性、日内和日间变化均在可接受范围内。对于这两种药物，该方法的日间和日内精度的变异系数均小于1% (表2)．

恢复的研究

根据ICH指南，回收率研究分别在80%、100%和120%的测试浓度下进行。STG和MET在所有三个水平上的回收率均令人满意(表3)．STG和MET的回收率分别为99.66% ~ 100.62%和99.12% ~ 101.67%。

检测限(LOD)和定量限(LOQ)

STG的检出限和定量限分别为7.08和21.82ng band-1, MET的检出限和定量限分别为19.31和58.51ng band-1，表明所建方法灵敏度高。

特异性

通过比较STG点和MET点的峰起点和峰终点位置的光谱，评价STG点和MET点的峰纯度，并将两者的光谱进行叠加，进行光谱匹配。

结论

所建立的HPTLC技术是分析药物制剂中STG和MET的精密度、特异性和准确性的方法。该方法可方便地用于药物的选择性分析，结果可重复，不受辅助物质干扰。该方法可成功应用于片剂制剂中STG和MET的同时估计，无需事先分离，不干扰质量控制。

致谢

作者感谢默克公司和Briosia公司赠送的纯STG和MET样品。我们也要感谢Anchrom实验室进行HPTLC方法的开发。

参考文献

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