验证和量化的多功能生物测定的常规应用厄他培南钠

文摘

一个有效的治疗代理是必不可少的许多传染病的控制可以预测目前的社会和经济成本高。厄他培南钠(ERTM)是一种人工合成的抗菌剂对革兰氏阴性的碳青霉烯类的行动,革兰氏阳性需氧和厌氧微生物。缺乏有效的新抗生素对耐多药病原体是一个常数问题。耐碳青霉烯的进步是令人担忧的问题,因为那些被认为是最重要的一个药物治疗肠道菌引起的严重感染。因此,有必要研究碳青霉烯药物的变化的状况。微生物抗菌效能评估方法是必需的。在浊度试验,药物的效力是由测量浊度(吸光度),造成微生物的抑制作用。本研究提出了一种高效、准确、可再生、低成本、微生物鉴定在制药行业高度相关的量化厄他培南钠。对于执行方法,金黄色葡萄球菌(写明ATCC 26923)是用作测试微生物培养基选择是脑心浸液肉汤,嗨。验证参数依照我的规格和精度,精度、选择性和健壮性与线性跟踪12.80; 16.00 and 20.00 μg mL-1. The turbidimetric assay is more versatile, faster and easier to apply than agar diffusion one. The method is simple and can be used in routine analysis of quality control of ertapenem sodium in the pharmaceutical industry.

关键字

生物测定,厄他培南钠、方法验证、微生物鉴定、质量控制、浊度的测定

介绍

抗菌素构成了一类最常用的药物。然而,缺乏针对耐多药的新有效的抗生素病原体是一个常数。厄他培南钠其他carbepenems中脱颖而出,这是目前作为第一个具有独特的化学特性,使其更耐β-lactamase酶,对有氧和厌氧微生物活动,代表了这一群体的一个突破。值得注意的是一些抗菌素目前可用的频谱活动对有氧和厌氧微生物1,2]。

厄他培南钠是区别于其他碳青霉烯通过拥有一个阴离子组成的侧链苯甲酸的分组。取代苯甲酸的目标是至关重要的维持其抗菌谱革兰氏阴性;此外,还增加了其分子量和亲油性,羧酸单位电离在净负电荷生理pH值的结果。因此,厄他培南是高度与血浆蛋白(大约95%)扩展它的半衰期,每天只允许一次方便的管理(1- - - - - -4]。此外,肾dehydropeptidase更稳定,不需要添加抑制剂的酶和其他类似的碳青霉烯(5]。厄他培南钠的化学结构所示图1。

尽管碳青霉烯是最强有力的β-lactam及其广泛的活动包括许多微生物耐药青霉素和头孢菌素,特微生物的开发是一个新兴的威胁,与几个报告在文献[6- - - - - -8]。

有许多因素会导致antimicrobial-resistant微生物的出现;这是一个自然进化的过程微生物的一种防御机制,但不正确的或滥用药物促进耐药病原体的出现,干涉治疗。另一个因素可能有利发展耐药病原体的是这些产品的质量差;因此,预防措施以减少耐药微生物的出现至关重要,一旦开发新的抗生素能对抗他们需要时间和高成本。

耐碳青霉烯的进步是令人担忧的问题,一旦这些被认为是最重要的一个药物治疗肠道菌引起的严重感染。因此,有必要研究的变化药理的碳青霉烯(9]。质量控制实验室的预防和控制是极其重要的传染性疾病(10]。然而,在文献中没有在这个日期之前,验证微生物方法评估的平均百分比ERTM制药形式用于质量控制。另一方面,琼脂扩散试验被用来评估活动对各种微生物(11,12]。

微生物测试,能够提供快速、准确的实验室结果,已成为至关重要的(10]。众所周知,它是制药公司的责任对微生物评估抗菌素的效力。我们的研究小组一直在试图表明,浊度的测定是一个替代方法的优点是速度远远超过在琼脂扩散法由于潜伏期的时间比浊测定只需要4 h与琼脂扩散,通常需要20多个小时的潜伏期。浊度计的生物测定是一个很好的方法来评估ERTM的平均比例,目前它已成功用于量化的抗菌药物13- - - - - -22]。

在这种背景下,已经被越来越多的关注使用的药品的质量和“意识”或关键的重要性,强调对问题的认识。有效的和可靠的分析方法能够量化的抗菌素,以及评估他们的活动,评估产品的质量至关重要,因为抗生素的剂量代理应该足以抑制微生物的生长负责感染,不允许返回的疾病。

厄他培南钠是一种抗菌剂,已被用来作为治疗剂治疗各种各样的传染病疾病被FDA批准,20011]然而仍然没有专著在任何官方纲要。很少有发表厄他培南生物矩阵和药物的分析方法(23- - - - - -26]。因为没有使用厄他培南红外定量方法进行验证,本研究的目的是开发一种新的简单、生态和健壮的红外方法使用体积小汤没有广泛的样品处理和残留的一代。

实验

化学药品和试剂

厄他培南钠98.8%(身份证号码1407011333 e)和厄他培南铸造注射用冻干粉(很多EB004C1)请&DohmeTM由默克公司捐赠的锋利。是使用的培养基大脑心浸液(BHI肉汤(OxoidTM)。甲醛分析品位,用来阻止微生物的生长,从(QhemisTM)购买。纯净水(美国MilliporeTM)中使用这两种方法都准备解决方案。

装置

垂直高压釜AV模型(凤凰Luferco、SP、巴西)是用于灭菌培养基15分钟在121°C。此外,我们使用纯化水、套管和试管直径25毫米x 150毫米高度,包含培养基和适时地用棉花塞裹着纱布。使用瓶孵化器孵化的微生物进行MA420模型(马可尼、SP、巴西)和烤箱央行数字1.2 (Odontobras、SP、巴西)。阅读,分光光度计使用DU 530(美国贝克曼库尔特,CA)。100 - 1000μL Micropipettor埃普多夫,分析天平模型H10(瑞士梅特勒-托利多)和半正弦平衡模型B160 (Micronal、SP、巴西)。Microsoft Excel软件(2010)被用来构造校正曲线。

解决方案

制备ERTM RS解决方案:ERTM RS股票的解决方案是由传输10毫克相当于ERTM RS 50毫升容量瓶,它充满了超纯水获得200μg毫升的浓度¹。整除的640年、800年和1000年μL ERTM RS股票的解决方案被转移到10毫升容量的玻璃瓶,超纯水的卷完成后,获取工作解决方案浓度为12.8,16.0和20.0μg毫升¹,表示为S1, S2和S3。

在冻干制备ERTM injectionsolution粉:五瓶ERTM冻干粉(商用注入制备的解决方案)的体重,和平均重量计算。这些瓶的内容不一。冻干粉的ERTM解决方案注入原液制备的相同的方式执行ERTM RS先前描述的解决方案。这些解决方案分别命名为T1、T2和T3。

培养基的制备

中准备显示在其各自的标签在超纯水溶解加热下,分布在试管(10毫升/管)和热压处理过的(条件:121°C, 1 atm) 15分钟。

生物测定

写明ATCC 26923株金黄色葡萄球菌是胰蛋白酶的大豆琼脂培养基上培养和维护冰箱和文化被转移到BHI肉汤和保持在35ºC±2ºC测定前的24小时。微生物标准化是根据巴西药典中描述的过程,2010年。细菌,之前在嗨肉汤,孵化与BHI肉汤稀释达到25±2%的悬浊度(透光率)和浊度测量使用分光光度计波长为580 nm使用10毫米吸收细胞,对BHI肉汤的空白。整除0.8毫升的标准化暂停添加到每个10毫升的BHI肉汤。3种不同浓度的水溶液厄他培南钠添加了参考标准在三个不同的试管》包含10毫升无菌BHI培养基分别(S1, S2和S3)。同样的程序进行了厄他培南钠测试样本(T1、T2和T3)和这样做是一式三份,根据平行线3 x 3巴西药典中描述的测试。然后,试管》被孵化瓶在35.0°C±1.0°C的温度为4小时。之后,抑制了微生物的生长0.5毫升的12%甲醛溶液的试管。最后,吸光度测定的分光光度计在530海里。

计算和方法验证

计算ERTM活动,使用线性并行模式从休伊特方程1(休伊特,2003)。

方程1。休伊特方程

力量(%)= AntilogM×100

M = F / b

b = E / L

地点:

我=剂量之比的对数

该方法验证根据国际协调会议指南(我2005)[27),协调指导IUPAC单实验室验证的分析方法(IUPAC, 2002)28),药物和生物制剂的分析方法和方法验证FDA(美国食品及药物管理局,2015)[29日),线性,选择性、准确性、精度、鲁棒性,检测和量化的限制。

线性:进行了线性回归分析厄他培南的钠。分析曲线是由策划的对数浓度与吸光度值的平均值,平均吸光度值每个ERTM concentration-RS 12.8浓度范围;16.0和20.0μg毫升¹。三个不同的试验进行了一式三份。由最小二乘法回归线计算。由方差分析统计评估。值被报道的平均值±s.d校准曲线。

精度:精度是由重复性(盘中精度)和中间精密度(inter-day精度)。7的性能决定的可重复性研究样本的平均浓度校准曲线(16μg毫升¹)。当天解决方案准备和分析在相同的实验条件下,中间精密度评价时的平均相对标准偏差百分比获得三个分析曲线上执行不同的日子(interday)和两种不同的分析师(分析师之间)。

鲁棒性:评估方法的鲁棒性,通过小改变参数,表明方法的有效性维护。以下参数是不同的:波长(528、530和532海里),培养基品牌(BHI-OxoidTM和BHI-BD-BactoTM)和不同的仪器(DU 530紫外可见分光光度计模型和模型uv - 1800,日本岛津公司)。

ERTM的平均百分比的分析冻干粉injectionwas在正常条件下,进行并行;这是改变的变化干扰的评估结果。获得的响应进行评估根据R.S.D.剂量。

准确性:精度通过恢复试验,实现了在一个已知数量的RS被添加到一个已知数量的样本(我2005)[27]。经济复苏进行了三个层次,R1, R2和R3, ERTM是根据准备的表1,一式三份。

表1:准备解决恢复测试的浊度厄他培南钠的生物测定

每个模拟样本(R1、R2和R3)化验在一个独立的审判。复苏的百分比(%)计算方程2由官方分析化学家协会(采用AOAC公认,2002)29日]。

方程2。复苏的百分比计算- R %

地点:

Cf之后总药物浓度测量的标准

铜是总配方的药物浓度

Ca是标准浓度添加到配方

结果与讨论

制药行业推动了医药市场,代表一个重要经济源。药物的定量方法的发展在生产过程中对质量至关重要控制这些产品在制药行业。制药行业的质量控制是非常重要的在这个过程中获得药物的质量、安全性、有效性和可信度的人口消耗它。

负责制药行业质量控制措施的开发和验证方法基于公认的官方引用。此外,它需要个人和专业资格,优化流程,减少浪费和时间,标准化的程序,在理化分析实验室和设备校准。

有效和可靠的分析方法能够量化的抗菌素的数量,以及评估他们的活动,评估产品的质量至关重要,因为抗菌药物的剂量足以抑制微生物的生长负责感染,而不允许返回的疾病。一个因素可能有利于耐药病原体的发展是这些产品的质量差。因此,预防措施的正确量化这些产品由于质量控制以减少耐药微生物的出现至关重要,因为开发新抗生素有能力打击他们,需要时间和高成本。在这种情况下,质量控制有重要的作用在确保正确的剂量,通过预防以减少耐药微生物的发展作出贡献。

以前的测试被执行规范中使用的最佳参数的方法。参数,如微生物培养基,培养时间和温度,稀释剂和药物的药物剂浓度是不同的。参数,提供了精确和可重复的结果,选择发展的方法和所示表2。

表2:评估标准参数ERTM-API浊度的方法。

后的方法验证了分析方法验证指南根据国际会议协调的建议下,2005年,巴西2003年的指导方针,和食品及药物管理局,2015 (27,29日- - - - - -31日]。参数分析:线性、精密度、准确度、选择性和鲁棒性。微生物金黄色葡萄球菌显示优秀的结果,通过显示线性和可再生的增长。该方法线性浓度12.80;16.00和20.00μg L¹样品化验,这使得平均百分比100%左右通过适当的并行性的直接标准。表3显示解决方案在不同浓度的吸光度值获得ERTM RS和ERTM冻干粉注入评估方法线性的解决方案。

表3:吸光度在微生物鉴定获得的线性评价比浊测定。

分析曲线ERTM由策划三个分析曲线的平均吸光度值与浓度的对数(图2)。

厄他培南钠RS的分析曲线是评价通过方差分析(表4)。

表4:吸光度方差分析,确定获得分析ERTM曲线,用比浊bioass。

该方法被证明是准确的,健壮和准确,换句话说,该方法生成的能力,较低的反应同样的样本,可重复的结果差异独立化验。

微生物方法特点,分析了与传统分析方法不同。浊度测定的分析曲线进行根据平行线3 x 3中描述巴西药典(2010)。药物的平均百分比计算方程的休伊特(32]。休伊特的方程使用的平均吸光度读数的解决方案获得ERTM RS的三个剂量和注射用冻干粉溶液,在每个测试表现一式三份和分析。

此外,该生物测定方法评价抗生素不是必要的质量调查最低抑制浓度(MIC)值。根据执行整个过程描述的建议在巴西药典(2010)。

因此,在制造和生物分析中继续发挥重要作用的抗生素药物的质量控制。比浊方法提供了重要的信息制药产品的生物活性,需要比这更低的运行时所需的琼脂扩散试验。因此,这两种方法一起创造完美结合的细菌对抗菌药物的质量和有效性进行评价。

从今以后,本研究提出了一种比浊测定,即药物的效力是由测量浊度(吸光度),造成微生物的抑制作用。初步测试进行标准化中使用的最佳参数的方法。参数,提供了精确和可重复的结果,选择发展的方法和所示表5。

表5:使用比浊bioassa方法验证的结果。

微生物金黄色葡萄球菌显示优秀的结果,通过显示线性和可再生的增长。该方法线性浓度12.80;16.00和20.00μg /毫升,这允许样本化验的平均百分比100%左右通过适当的并行性的直接标准。分析曲线ERTM由策划三个分析曲线的平均吸光度值与浓度的对数(图2)。

这里开发的方法不使用任何有机溶剂进行分析,因此被认为是环保的,因为他们不会导致任何问题化学浪费或接触实验室工作人员的风险。因此,提出了质量控制的方法是有用的ERTM医药产品。

获得的结果与微生物比浊法测定的对比与那些通过紫外分光光度法测试t-Student来验证是否可以互换的两种方法。方差分析表明这些方法之间无显著差异(p = 0.25)。

通常用作常规理化检测方法量化的药物在制药行业。然而,众所周知,这些方法不能评价微生物活动。在这种背景下的生物测试,盟友理化分析,必须用于常规分析。浊度测试是合适的,简单的,特别是一个快速方法相比传统的琼脂扩散试验。方法通过琼脂扩散,在它的局限性,一些药物的扩散系数的困难固体培养基,也必须有定义良好的抑制区,与合适的直径进行验证和进一步可能有反应培养基和药物在某些情况下(20.,33- - - - - -39]。

结论

这样比浊法干扰因素减少,因为测试是表现在肉汤培养基。所有参数评估方法验证的满意,以及回归和并行性的结果。本文提出一种更快,更容易应用和评估可行的实现方法的平均百分比厄他培南钠冻干粉溶液注入,这是安全的,符合国家和国际指南的规定。

确认

我们非常感谢实验室默克大幅& Dohme捐赠的药物,和,Fundacao德帕罗尽管Estado de圣保罗,巴西,项目2013/12959-0 2015/03412-3,CNPq(慰问Nacional de DesenvolvimentoCientifico e学府,国家技术和科学发展的顾问,巴西利亚,巴西)的金融支持。

感兴趣的宣言

作者报告没有利益的声明。

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